Fő tartalom

A baktériumok transzformációja és szelekciója

Plazmid DNS bejuttatása baktériumokba. A baktériumok szelekciója. Fehérjék termelése és tisztítása.

Főbb pontok

A baktériumok transzformáció során képesek idegen DNS-t felvenni környezetükből.
A transzformáció a DNS klónozásának egyik fontos lépése. Ezzel a módszerrel juttatják be a baktériumsejtekbe a restrikciós emésztés és ligálás során újonnan létrehozott plazmidokat.
A transzformációt követően a baktériumokat antibiotikumos táptalajon szelektálják. A plazmiddal rendelkező baktériumok antibiotikum-rezisztensek, így ezekből egy-egy kolónia alakul ki.
A megfelelő plazmidot tartalmazó kolóniákból baktériumkultúra állítható elő. Ez a tenyészet teljesen egyforma sejtek tömege, amely felhasználható a plazmid, vagy az általa kódolt fehérje termelésére.

A DNS klónozása

A baktériumok transzformálása és szelekciója a DNS-klónozás kulcsfontosságú lépései. A DNS-klónozás során sok másolatot készítenek egy bizonyos DNS-darabról, például egy génről. Ezek a másolatok gyakran baktériumsejtekben készülnek.

Egy tipikus klónozási eljárás során a kutatók először beültetnek egy darab DNS-t, például egy gént egy plazmidnak nevezett kör alakú DNS-be. Ehhez restrikciós enzimeket és DNS-ligázt használnak, ezért ezt a lépést ligálásnak nevezzük.

A ligálás után következik a transzformálás, a DNS bejuttatása a baktériumsejtbe. Ezután antibiotikumos szelekcióval vagy a DNS vizsgálatával kiderítik, hogy mely baktériumsejtekbe jutott be a kérdéses plazmid.

A baktériumtranszformáció és a szelekció lépései

A baktériumtranszformáció és a szelekció általános menete:

A speciálisan előkészített baktériumokat összekeverik (pl. ligálásból származó) DNS-sel.
A baktériumokat hősokknak vetik alá, ennek hatására a sejtek egy része felveszi a plazmidokat.
A klónozáshoz használt plazmidok egy antibiotikum-rezisztencia gént is tartalmaznak. A baktériumokat antibiotikumos táptalajra helyezik, hogy kiválogassák azokat, amelyek felvették a plazmidot.

A plazmidot fel nem vett baktériumok elpusztulnak. Minden egyes baktériumból, amely rendelkezik plazmiddal, kifejlődik egy telep, amely a plazmidot tartalmazó, genetikailag azonos sejtek tömege.
A telepeket megvizsgálják (például PCR vagy restrikciós emésztés segítségével), hogy megtalálják azokat, amelyek felvették a megfelelő plazmidot.
Az olyan telepeket, amelyek tartalmazzák a megfelelő plazmidot, nagy tömegben tovább tenyésztik, hogy felhasználják a plazmid, vagy az általa kódolt fehérje termelésére.

Miért kell átvizsgálni a telepeket?

A telepeket alkotó összes baktériumnak tartalmaznia kell a plazmidot, hiszen ez biztosítja számukra az antibiotikum-rezisztenciát. Ennek ellenére nem feltétlenül igaz, hogy minden plazmidot tartalmazó telep ugyanolyan plazmiddal rendelkezik.

Hogyan lehetséges ez? A DNS szabás-varrása közben gyakran keletkeznek melléktermékek a kívánt plazmid mellett. Például amikor egy adott restrikciós enzimmel megpróbálunk beilleszteni egy gént egy plazmidba, előfordulhat, hogy a plazmid a gén beépülése nélkül visszazáródik, vagy a gén fordított irányban épül be.

Tegyük fel, hogy egy gént szeretnénk beépíteni egy plazmidba, hogy azután baktériumokban kifejezzük. Ehhez a gént úgy kell „beilleszteni” a plazmidba, hogy az a promóter után kerüljön, és a helyes irányba mutasson:

Tegyük fel, hogy ugyanazzal az enzimmel hasítottuk a gént és a plazmidot, majd egyesítettük őket DNS-ligáz segítségével. Néhány esetben a plazmid DNS és a gén DNS megfelelően fog összekapcsolódni, és a kívánt rekombináns plazmid jön létre. Más esetekben viszont a plazmid egyszerűen visszazáródhat (a gén beépülése nélkül), vagy a gén fordított irányban épül be. Fordítva beépült génről nem fejeződhet ki fehérje a baktériumban.

A ligálási reakcióban nagyon sok DNS vesz részt (több milliárd plazmid és több milliárd génmásolat). Ezért minden ligálásnál egyaránt keletkeznek „jó” és „rossz” plazmidok is. Minden telep egyetlen sejtből indul ki, aminek egyetlen plazmidja van („jó” vagy „rossz”), így végül a telep összes sejtjében ugyanilyen plazmid lesz.

A restrikciós enzimekről és a DNS-ligázról szóló leckéből pontosabban is megtudhatod, hogyan és miért keletkeznek a különféle ligálási termékek.

Miért fontos az, hogy a gén ne fordítva épüljön be a plazmidba? Vannak esetek, amikor ez egyáltalán nem számít. Ha viszont azt szeretnénk, hogy a gén ki is fejeződjön a baktériumban, azaz fehérje termelődjön, akkor a gént tartalmazó szakasz irányultsága meg kell, hogy egyezzen a promóter, azaz a kifejeződést szabályozó szakasz irányával. Ha a gén iránya ezzel ellentétes, akkor a DNS-nek a másik szála íródik át, és nem készül fehérje.

A fentiek miatt fontos, hogy plazmid DNS-t nyerjünk ki minden telepből, és megvizsgáljuk, hogy az egyezik-e a létrehozni kívánt plazmiddal. A telepekből származó plazmid DNS vizsgálatára gyakran alkalmaznak restrikciós emésztést, PCR-t és DNS szekvenálást.

Fehérjetermelés baktériumokban

Tegyük fel, hogy találunk olyan telepet, amely a „jó” plazmidot tartalmazza. Mi jön ezután? Mi a transzformáció, a szelekció és az elemzés végső célja?

1. lehetőség: plazmidokat gyártó baktériumok

Egyes esetekben a baktériumok egyszerű „plazmidgyárként” használhatók, nagy mennyiségű plazmid DNS termelésére. A plazmid DNS – egyéb kísérletek mellett – további DNS-klónozási kísérletekre is használható (például összetettebb plazmidok készítésére).

Máskor a plazmidokat közvetlen gyakorlati célokra használják. Nemrégiben például egy génterápiás klinikai kísérlet során plazmidokkal juttattak be emberi gént a cisztás fibrózis nevű örökletes betegségben szenvedő betegek tüdejének sejtjeibe.

^{1}

2. lehetőség: baktériumok mint fehérjegyárak

Más esetekben a baktériumok „fehérjegyárakként” hasznosíthatók. Egyes vezérlő szakaszokat a plazmidba építve elérhető, hogy a baktériumok egy kémiai jel hatására kezdjék kifejezni el a plazmidban kódolt fehérjét. A gén kifejeződése során mRNS képződik, ami alapján fehérje készül. Ezután a baktériumok felnyitása (lízise) után kinyerhető belőlük a fehérje.

A baktériumok sokféle fehérjét és más makromolekulát tartalmaznak, ezért a termeltetett fehérjét tisztítani kell (azaz el kell választani a többi fehérjétől és más makromolekuláktól), mielőtt felhasználják. A fehérjetisztításnak számos módszere létezik.

Az affinitás kromatográfia nevű eljárás során a lizált baktériumokból kinyert molekulák keverékét átfolyatják egy oszlopon vagy hengeren, amely gyöngyöket tartalmaz. A gyöngyök antitestekkel, azaz immunfehérjékkel vannak bevonva, amelyek specifikusan képesek kötődni egy-egy adott molekulához.

Az oszlopban található antitesteket úgy tervezték, hogy csak az elválasztani kívánt fehérjét kössék meg, semmi mást a keverék molekulái közül. Így a célfehérje megkötve marad az oszlopon, míg minden más molekula lemosható. Az utolsó lépésben a célfehérjét is leoldják az oszlopról, és összegyűjtik további felhasználásra.

A Khan Academyn kívüli további információk

Szeretnél többet megtudni a baktériumtranszformációról? Nézd meg ezt a szimulációt (angolul) a LabXchange weboldalán!

Szeretnél többet megtudni a transzformált baktériumok szelekciójáról? Nézd meg ezt a szimulációt a LabXchange weboldalán!

A LabXchange ingyenes online természettudományos oktatási platform, amelyet a Harvard’s Faculty of Arts and Sciences hozott létre, és amelynek az Amgen Foundation a támogatója.

Ez a tananyag a CC BY-NC-SA 4.0 licenc által engedélyezett.

Idézett munkák:

Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

További hivatkozások:

Affibody. (n.d.). Insulin capture from human serum. Hozzáférhető itt: http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.

Amgen Biotech Experience. (2015). Student guide. Hozzáférhető itt: https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.

Bacterial transformation: The heat shock method. (2016). In (2016). In JoVE science education database. Hozzáférhető itt: http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method.

Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (2015, July 3). In NHS choices. Hozzáférhető itt: http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. In Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (2016, March 23). Gene cloning - advanced. In CK-12 biology advanced concepts. Hozzáférhető itt: http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

Szeretnél részt venni a beszélgetésben?

Jelentkezz be

Rendezés:

Még nincs hozzászólás.

Tudsz angolul? Kattints ide, ha meg szeretnéd nézni, milyen beszélgetések folynak a Khan Academy angol nyelvű oldalán.

Biológia

Tantárgy/kurzus: Biológia > 9. témakör