Fő tartalom

A DNS bázissorrendjének meghatározása (DNS-szekvenálás)

Hogyan határozható meg egy DNS-szakasz bázissorrendje (az A, T, C, G nukleotidok sorrendje)?

Főbb pontok

A DNS-szekvenálás a nukleotidok (A, T, C, G) szekvenciájának, vagyis sorrendjének meghatározása egy DNS-darabban.
A Sanger-szekvenálás során a szekvenálni kívánt DNS-darabról sok másolatot készítünk, melyek hossza eltérő lesz. Ezek az eltérő hosszúságú töredékek a fragmentek. Az egyes fragmentek végét fluoreszcens „lánczáró” nukleotidok jelölik, amelyek lehetővé teszik a szekvencia meghatározását.
Az új generációs szekvenálási technikák olyan új, nagy mennyiségű DNS-sel dolgozó módszerek, melyekkel gyorsabban és olcsóbban lehet DNS-t szekvenálni.

Mi az a szekvenálás?

Valószínűleg hallottál már a genomok szekvenálásáról. Például a humán genomot 2003-ban határozták meg, sok éves nemzetközi kutatás eredményeképpen. De mit is jelent egy genom, vagy akár csak egy kisebb DNS-szakasz szekvenálása?

A DNS-szekvenálás a nukleotidok (A, T, C, G) szekvenciájának, sorrendjének meghatározása egy DNS-darabban. Manapság a megfelelő műszerekkel és anyagokkal egy rövid DNS-darab szekvenálása már viszonylag egyszerű feladat.

Egy teljes genomnak (vagyis egy élőlény összes DNS-ének) a szekvenálása továbbra is igen összetett feladat. Ehhez a genom DNS-ét kisebb szakaszokra, fragmentekre kell darabolni, majd az egyes fragmentek szekvenciáját külön-külön meghatározni, végül ezeket a szekvenciákat összeilleszteni egy hosszú „konszenzus” szekvenciává. Mindez hosszadalmas folyamat, mégis, az elmúlt két évtizedben fejlesztett új eljárásoknak köszönhetően a genom szekvenálás már sokkal gyorsabb és olcsóbb eljárás, mint egykor, a Humán Genom Projekt (Human Genome Project) idejében

^{1}

Ebben a fejezetben áttekintjük a DNS-szekvenálás néhány módszerét. Főként egy már jól bejáratott technikát, a Sanger-szekvenálást fogjuk tárgyalni, de szó esik majd új generációs ("next-generation", NG) módszerekről is, melyek a nagy szekvenáló projektek költségeit jelentősen csökkentették, ugyanakkor a folyamatot sokkal gyorsabbá tették.

Sanger-féle szekvenálás: a láncterminációs módszer

A körülbelül

900

bázispár hosszú DNS-darabok szekvenálására rutinszerűen alkalmazható a Sanger-szekvenálás, vagy más néven láncterminációs eljárás. A Sanger-szekvenálást a brit biokémikus, Fred Sanger és munkatársai dolgozták ki 1977-ben.

A Humán Genom Projekt során hosszabb-rövidebb szakaszokra hasították az emberi génállományt alkotó DNS-t, majd az egyes fragmentek szekvenciáját Sanger-szekvenálással határozták meg. (Ezek a töredékek sokszor jóval hosszabbak voltak, mint

900

bázispár, de a kutatók ilyen esetekben több egymást követő szekvenálási művelettel képesek voltak meghatározni a bázispárokat a teljes szakaszon.) A kapott szekvenciákat a darabok közti átfedések révén sorba tudták rendezni, így egyre nagyobb részek, végül pedig teljes kromoszómák szekvenciáját tudták felírni.

Bár ma már jellemzően gyorsabb és olcsóbb módszerekkel végzik teljes genomok szekvenálását, a Sanger-szekvenálást továbbra is széles körben alkalmazzák rövidebb DNS-darabok szekvenálására. Ilyen eset például a DNS klónozás során használt fragmentek meghatározása, vagy a polimeráz láncreakció (PCR) során keletkezett termékek szekvenálása.

A Sanger-szekvenálás „hozzávalói”

A Sanger-szekvenálás során a meghatározandó DNS-szakaszról sok másolat készül. A „hozzávalók” nagyban hasonlítanak az élőlényekben lezajló DNS-replikáció, vagy az in vitro körülmények között végzett polimeráz láncreakció (PCR) összetevőihez. Ezek a következők:

Egy DNS polimeráz enzim
Egy primer, vagyis egy rövid, egyszálú DNS-szakasz, ami a templát szálhoz kötődik, és amit a polimeráz enzim a lánchosszabbítás kiinduló pontjaként tud használni
A négyféle DNS nukleotid, monomer formában (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
A DNS templát szála, amit szekvenálni szeretnénk

A Sanger-szekvenáláshoz a fentieken túl még egy különleges „hozzávaló” is szükséges:

Didezoxi-, vagyis lánctermináló (lánczáró) verziók mind a négy típusú nukleotidból (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), ezek mindegyike meg van jelölve az adott típusra jellemző festékkel

_Az ábra forrása: "Whole-genome sequencing: Figure 1," OpenStax College, Biology (CC BY 4,0)._

A didezoxi-nukleotidok hasonlítanak a hagyományos, vagyis dezoxi-nukleotidokra, de egy fontos dologban eltérnek: nincs hidroxil-csoportjuk a cukorgyűrű 3. szénatomján. Egy hagyományos nukleotidban a 3. szénatom hidroxil-csoportja felelős a lánc hosszabbodásáért, vagyis egy új nukleotid csak ide tud kapcsolódni.

Ha egy DNS-szálba egy didezoxi-nukleotid épül be, a hidroxil-csoport hiánya miatt további nukleotidok már nem tudnak kapcsolódni. Így a lánc szintézise véget ér az adott didezoxi-nukleotiddal, amelynek típusát (A, T, C vagy G) a hozzá kötött festék egyértelműen jelöli.

A Sanger-szekvenálás lépései

A szekvenálandó templát szálat egy kémcsőben összekeverik a primerrel, a DNS polimerázzal és a négyféle DNS-nukleotiddal (dATP, dTTP, dGTP és dCTP). A négyféle, festékkel jelölt didezoxi-nukleotidot is hozzáadják az elegyhez, de jóval kisebb mennyiségben, mint a hagyományos nukleotidokat.

Az elegyet először melegítik, hogy a templát DNS denaturálódjon (vagyis a két szál elváljon egymástól), majd lehűtik annyira, hogy a primer csatlakozhasson az egyszálú templáthoz. Miután ez megtörtént, a hőmérsékletet újra megemelik, így a DNS polimeráz képes lesz szintetizálni az új DNS-szálat a primer folytatásaképp. A polimeráz folyamatosan építi az új láncot egészen addig, míg véletlenül egy didezoxi-nukleotidot nem épít be egy hagyományos nukleotid helyett. Ezután már további nukleotidok nem tudnak beépülni, így az új lánc véget ér a didezoxi-nukleotiddal.

Ezt a folyamatot rengetegszer megismétlik. Mire végeznek az összes ismétléssel, gyakorlatilag garantálható, hogy az eredeti templát minden egyes nukleotidjára jutott legalább egy reakció, amely során didezoxi-nukleotid épült be az adott helyre. Ez azt jelenti, hogy a kémcsőben számos eltérő hosszúságú DNS-fragment lesz jelen, illetve az eredeti DNS minden nukleotidjára jut legalább egy fragment, amelynek utolsó nukleotidja az adott típusra jellemző festékkel jelölt. Tehát ha a 18. nukleotid például A volt, akkor az ismétlések végére lesz legalább egy olyan 18 neukleotid hosszúságú fragment, amely utolsó nukleotidja jelölt ddA lesz (lásd az alábbi ábrát is).

Nem, nem mindegyik. Teljesen véletlenszerű, hogy egy adott lánchosszabbító reakció során a polimeráz enzim didezoxi-nukleotidot vagy hagyományos nukleotidot használ. Néhány esetben előfordulhat, hogy csupa hagyományos nukleotidot használva az enzim végigér a templáton, majd leválik róla. Ilyen esetekben az új szálban csak hagyományos nukleotidok szerepelnek majd, lánczáró didezoxi-nukleotid nem. Ezek a jelöletlen DNS-molekulák nem fogják zavarni a szekvenálást, hiszen „láthatatlanok” a detektálás során, tekintettel arra, hogy nem található rajtuk semmilyen jelölő festék.

A módosított kép forrása:"Sanger sequencing," Estevezj nyomán (CC BY-SA 3,0). A módosított kép a (CC BY-SA 3,0) licensz alatt áll.

Miután az ismétlések véget érnek, a fragmenteket egy gél mátrixot tartalmazó, hosszú és vékony csövön futtatják keresztül. Ezt az eljárást kapilláris gélelektroforézisnek nevezzük. A rövidebb fragmentek gyorsabban, míg a nagyobbak lassabban jutnak át a gél pórusain. (Ha egy adott fragmentből több másolat is előfordul, akkor azok természetesen együtt mozognak.) A célvonalon átlépve lézerrel világítják meg a fragmenteket, ami felfedi a kérdéses festék színét.

A legrövidebb fragment ér át elsőként a kapillárison, ami tulajdonképpen maga a primer és egy további nukleotid. Ezt követi a második legrövidebb fragment (amely a primeren túl két nukleotidból áll), és így tovább. Így egyesével meghatározva az áthaladó fragmentekhez kapcsolódó festék színét, vagyis az adott fragment utolsó nukleotidjának típusát, egyesével felépíthető az eredeti templát DNS-nek megfelelő (illetőleg a másolás logikája miatt első körben a templáttal komplementer) szekvencia. A detektor által gyűjtött adatsor kiugró fluoreszcens jelek sorozata lesz, ezt nevezzük kromatogramnak. A szekvencia leolvasható a kromatogrammon látható csúcsok alapján.

Felhasználás és korlátok

A Sanger-szekvenálással megbízható pontossággal határozhatjuk meg viszonylag hosszú (akár

900

bázispárnyi) DNS-fragmentek szekvenciáját. A módszert általában kisebb önálló DNS-darabok, például bakteriális plazmidok vagy polimeráz láncreakció (PCR) során keletkező DNS-fragmentek szekvenálására használják.

A Sanger-szekvenálás azonban drága és nem elég hatékony nagyobb léptékű projektek, például teljes genom szekvenálása, vagy egy ún. metagenom (egy mikroba közösség „kollektív genomja”) meghatározása esetén. Ezekhez már új, nagy volumenű szekvenáló technikákat szokás alkalmazni, melyek gyorsabbak és kevésbé költségesek is.

Új generációs szekvenálás

Az új generációs jelző miatt a név úgy hangzik, mint egy filmcím, de valóban így hívják ezeket a módszereket! A legújabb DNS-szekvenáló technikákat összefoglaló néven új generációs szekvenálásnak nevezzük.

Több ilyen új generációs technika is létezik, mindegyik más és más módszertanra épül. Sok esetben vannak azonban olyan közös tulajdonságok, amelyek elkülönítik őket a Sanger-szekvenálástól:

Szinkronitás: nagyon sok szekvenálási reakció zajlik le bennük párhuzamosan
Kis lépték: a reakciók nagyon kevés helyet foglalnak, így egyszerre nagyon sok végezhető el belőlük egyetlen chipen
Gyorsaság: mivel a sok reakció párhuzamosan zajlik, sokkal hamarabb készülnek el az eredmények
Kis költségvetés: egy teljes genom szekvenálása olcsóbb, mint Sanger-szekvenálással
Rövidebb olvasási hossz: az egy reakcióban szekvenált templátok hossza jellemzően $50$ ‍ $-$ ‍ $700$ ‍ nukleotid

Az új generációs szekvenálási technikák alapvetően olyanok, minta egyszerre nagyon sok kisebb Sanger-szekvenálást végeznénk. Az új generációs módszerek alkalmazásával, köszönhetően a szinkronitásnak és a kis léptéknek, nagyobb mennyiségű DNS is lényegesen gyorsabban és olcsóbban szekvenálható, mint a Sanger-szekvenálással. Például amíg 2001-ben a teljes humán genom szekvenálásának költsége közel

100

millió dollár

volt, addig ez 2015-re már

1245

dollárra

^{2}

csökkent (vagyis kb. 30 milliárd forintról mintegy 373 500 forintra)!

Miért fontos a gyors és olcsó szekvenálás? Annak lehetősége, hogy rutinszerűen szekvenáljunk meg genomokat, teljesen új távlatokat nyit meg a biológiai kutatásokban, és a gyógyászatban is. Például az olcsó szekvenálás hatalmas lépést jelent a személyre szabott gyógyászat felé, vagyis abba az irányba, hogy egy adott kezelést a páciens génjei által meghatározott szükségleteknek megfelelően tudjunk módosítani.

Hivatkozás és referenciák:

Ez a cikk az OpenStax College, Biology (CC BY 4,0) "DNA structure and sequencing" című cikkének módosított változata. Az eredeti ingyenesen letölthető innen: http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@10,4.

A módosított cikket a CC BY-NC-SA 4.0 licenc által engedélyezték.

Idézett munkák:

Lewis, T. (2013. április 14). Human genome project marks 10th anniversary. In LiveScience. Hozzáférhető itt: http://www.livescience.com/28708-human-genome-project-anniversary.html.
National Human Genome Research Institute. (2016. január 15). DNA sequencing costs. In Large-scale genome sequencing and analysis centers (LSAC). Hozzáférhető itt: https://www.genome.gov/sequencingcosts/.

További hivatkozások:

Obenrader, S. (2003). The Sanger method. In Sarah Obenrader: Molecular biology. Hozzáférhető itt: http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Obenrader/sanger_method_page.htm.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Dideoxy chain termination method for sequencing DNA. In Campbell biology (10. kiadás 410. o.). San Francisco, CA: Pearson.

Thermo Fisher Scientific. (2016). Sanger sequencing method. In Sanger sequencing. Hozzáférhető itt: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/sequencing/sanger-sequencing/sanger_sequencing_method.html.

Szeretnél részt venni a beszélgetésben?

Jelentkezz be

Rendezés:

Még nincs hozzászólás.

Tudsz angolul? Kattints ide, ha meg szeretnéd nézni, milyen beszélgetések folynak a Khan Academy angol nyelvű oldalán.

Biológia

Tantárgy/kurzus: Biológia > 9. témakör