Fő tartalom

A DNS klónozása (áttekintés)

A DNS-klónozás fogalma, célja és alapvető lépései.

Főbb pontok

A DNS klónozása molekuláris biológiai eljárás, amelynek során nagy számú másolat készül egy DNS-darabról, például egy génről.
A klónozás lényege egy gén beépítése egy plazmidba, amely egy körkörös DNS-darab.
A plazmidot a transzformáció nevű eljárással baktériumokba juttatják. A plazmidot hordozó baktériumokat antibiotikumok segítségével válogatják ki.
A megfelelő plazmidot hordozó baktériumok felhasználhatók a plazmid DNS sokszorosítására, illetve a gén kifejezésére, azaz fehérjetermelésre.

Bevezetés

A „klónozás” szó hallatán legtöbben egy teljes élőlény klónozására gondolnak, mint például Dolly, a bárány esetében. Valamit klónozni azonban csupán azt jelenti, hogy genetikailag pontos másolatot készítünk róla. A molekuláris biológiai laboratóriumokban többnyire géneket vagy egyéb DNS-darabkákat klónoznak.

Ha a molekuláris biológus barátod azt panaszolja, hogy nem megy neki a „klónozás”, akkor minden valószínűséggel DNS-darabkákat próbál másolni, és nem egy újabb Dollyt akar készíteni!

A DNS-klónozás áttekintése

A DNS klónozása során nagy számú pontos másolatot készítenek a DNS egy bizonyos részletéről. A tipikus klónozási eljárásokban a kérdéses gént vagy más DNS-szakaszt (például egy gyógyászati jelentőségű emberi fehérje génjét) először beépítik egy plazmidba, amely egy körkörös DNS-darab. A beépítést a „kivágás és beillesztés” elvén működő enzimek végzik. Eredménye a rekombináns DNS, azaz olyan DNS, amely különböző forrásokból származó darabokból van összerakva.

A rekombináns plazmidot ezután baktériumokba juttatják be. A plazmidot hordozó baktériumokat kiválogatják és tenyészetik. Szaporodásuk közben ezek lemásolják a plazmidot, amit aztán továbbadnak az utódaiknak, azaz sokszorosítják a benne lévő DNS-t.

Mi értelme másolatokat készíteni egy plazmidba ágyazott DNS-szakaszról? Egyes esetekben kísérletekhez, vagy új plazmidok készítéséhez van szükség sok DNS-másolatra. Máskor a kérdéses DNS-darab valamilyen hasznos fehérjét kódol, a baktériumok pedig a fehérjét előállító „gyárakként” használhatók. A cukorbetegek számára szükséges inzulint például olyan E. coli baktériumokkal termeltetik, amelyekben az emberi inzulin génje fejeződik ki.

Ha a családodban vagy a barátaid között van cukorbeteg, akkor tudhatod, hogy az inzulin nevű hormon fontos szerepet játszik az egészségünkben. Egészséges emberekben a hasnyálmirigy termeli az inzulint, amely a vérárammal jut a sejtekhez, és hozzájuk kapcsolódva elősegíti a glükóz nevű cukor felvételét.

Az I-es típusú cukorbetegekben a hasnyálmirigy inzulintermelő sejtjei károsodnak vagy elpusztulnak. A betegségben szenvedők rendszeres injekciók formájában jutnak a külső forrásból származó inzulinhoz, amely segít megelőzni a veszélyesen magas vércukorszintet (és segíti a sejtek üzemanyagául szolgáló cukor felvételét).

Az I-es típusú cukorbetegek számára szükséges inzulint sok-sok éven át a levágásra szánt disznókból és marhákból nyerték ki. A sertés- és a marhainzulin hasonlítanak az emberi inzulinhoz, ezért alkalmasak annak helyettesítésére az I-es típusú cukorbetegek szervezetében.

A kutatók azonban az 1980-as évektől kezdve új technológiát dolgoztak ki az inzulin előállítására Escherichia coli (E. coli) baktériumok felhasználásával. A baktériumokat lényegében apró inzulintermelő gyárakká alakították át. Napjainkban az I-es típusú cukorbetegség kezelésére elsősorban ezt a rekombináns inzulint használják, amelyet különböző eredetű (emberi és bakteriális) DNS-ek kombinálásával állítanak elő.

A DNS-klónozás lépései

A DNS-t sokféle célból klónozzák. Példaként tekintsük át, miként használható a DNS-klónozás baktériumokban végzett fehérjetermelésre (például emberi inzulin előállítására). A főbb lépések a következők:

Vágjuk fel a plazmidot, és „illesszük bele” a gént. Ehhez szükség van restrikciós enzimekre (a DNS elhasításához) és DNS-ligázra (a DNS összeillesztéséhez).
Juttassuk be a plazmidot baktériumokba. Antibiotikumot alkalmazva válogassuk ki, hogy melyek azok a baktériumok, amelyek felvették a plazmidot.
Tenyésszük a plazmidokat tartalmazó baktériumokat, és működtessük őket mint „fehérjegyárakat”. Tisztítsuk meg a baktériumokból kinyert fehérjéket.

Vegyük szemügyre részletesebben az egyes lépéseket.

1. A DNS kivágása és beillesztése

Hogyan kapcsolhatók össze a különböző eredetű DNS-ek? A közismert eljárás kétfajta enzimet alkalmaz: restrikciós enzimeket és DNS-ligázt.

A restrikciós enzim olyan DNS-hasító enzim, amely egy általa felismert bázissorrend mentén vagy annak közelében hasítja ketté a DNS-t. Számos restrikciós enzim rövid, egyszálú, túlnyúló szakaszokat képez a hasítási termékek végein. Az egymáshoz illeszkedő végekkel rendelkező molekulák bázispárokat képezve összetapadhatnak. Teljesen ép DNS-molekulává viszont csak a DNS-ligáz kapcsolja össze őket, befoltozva a foghíjakat a DNS gerincében.

Klónozáskor az a cél, hogy beépítsünk egy gént (például az emberi inzulin génjét) egy plazmidba. Egy gondosan kiválasztott restrikciós enzimmel megemésztetjük az alábbiakat:

A plazmidot, amely egyetlen hasítási helyet tartalmaz
A beépítendő gént tartalmazó szakaszt, amelynek mindkét vége közelében található egy-egy hasítási hely.

Ezután a töredékeket DNS-ligázzal kezeljük, amely azokat összekapcsolva létrehozza a rekombináns plazmidot, ami tartalmazza a beültetett gént.

2. A baktériumok transzformációja és szelekciója

A transzformáció az a folyamat, amelynek során plazmidokat vagy egyéb DNS-t juttatnak be a baktériumokba, például a laboratóriumokban használt, ártalmatlan E. coli-ba. A transzformáció során a speciálisan előkészített baktériumsejteket sokkhatással (például magas hőmérséklettel) késztetik arra, hogy felvegyék az idegen DNS-t.

A plazmidokban rendszerint jelen van egy antibiotikum-rezisztencia gén, amely a baktériumot képessé teszi arra, hogy életben maradjon egy adott antibiotikum jelenlétében is. A plazmidot felvett baktériumok így szelektíven tenyészthetők az antibiotikumot tartalmazó táptalajon. A plazmidot nem tartalmazó baktériumok elpusztulnak, míg a plazmidot hordozó baktériumok életben maradnak, és szaporodnak. Minden életben maradt baktériumból kifejlődik egy apró, pontszerű telep, amely az egyforma plazmidot hordozó baktériumok tömege.

Nem minden telep tartalmazza szükségszerűen a megfelelő plazmidot. A ligálás során ugyanis a DNS-töredékek nem mindig pontosan a kívánt módon épülnek be. Sok-sok telepből kell DNS-mintát venni, hogy lássuk, vajon a megfelelő plazmidot tartalmazzák-e. A plazmidok vizsgálatára elterjedten használt eljárások a restrikciós enzimes emésztés és a PCR.

3. A fehérjék előállítása

Ha sikerült olyan telepet találni, amelyikben jelen van a megfelelő plazmid, akkor a plazmidot hordozó baktériumokból kultúrát (nagy sejttenyészetet) hozhatunk létre. A baktériumokat ezután kémiai úton utasíthatjuk arra, hogy kezdjék el termelni a kívánt fehérjét.

A baktériumok miniatűr „gyárakként” nagy mennyiségű fehérjét termelnek. Ha például a plazmid az emberi inzulin génjét tartalmazta, akkor a baktériumok ezt a gént írják át mRNS-sé, amely alapján tömegesen állítják elő az emberi inzulin fehérjemolekuláit.

Az emberek és a baktériumok ugyanazt a genetikai kódot használják, vagyis egy emberi gén átírása és lefordítása baktériumokban is végbemehet.

Ahhoz, hogy egy emberi gén baktériumokban is kifejeződhessen, egy fontos módosítás szükséges: a gén nem tartalmazhat intronokat. Az intronok számos emberi génbe beépülve előforduló bázisszekvenciák, amelyek az eukariótákban az úgynevezett splicing során vágódnak ki az átírt RNS-ekből, vagyis az érett mRNS-ben már nincsenek jelen. A baktériumokban nincsenek intronok, és nem képesek utólag módosítani az átíródott RNS-eket.

Hogyan készíthető olyan emberi gén, amely nem tartalmaz intronokat? Az intronmentes génváltozat a génről átírt mRNS alapján állítható elő a reverz transzkriptáz enzim segítségével. A reverz transzkriptáz olyan enzim, amely mRNS-minta alapján DNS-szálat szintetizál. Miután a keletkezett DNS-t egy további lépésben kétszálúvá alakítják, elkészül a gén intronmentes változata, az úgynevezett cDNS (komplementer DNS).

A megtermelt fehérje kinyerhető a baktériumsejtekből. A baktériumokban a kívánt fehérje (pl. az inzulin) mellett még számos más fehérje és egyéb makromolekula is jelen van. A megtermelt fehérjét ezért tisztítani kell, vagyis biokémiai úton el kell különíteni a sejt egyéb összetevőitől. A tisztított fehérje ezután felhasználható kísérleti célra, vagy pedig, mint például az inzulin esetében, beadható a betegeknek.

Nos... igen is, meg nem is. A gyógyszercégek által gyártott rekombináns inzulint valóban baktériumok állítják elő, olyan plazmid alapján, amely az emberi inzulin génjének a módosított változatát tartalmazza. A baktériumok által termelt inzulint oszlopkromatográfiás eljárással tisztítják.

A biológiailag aktív inzulin előállítása néhány további lépést igényel. Az inzulin egyetlen polipeptid lánc alakjában keletkezik. A láncon belül azonban még diszulfid kötéseknek is ki kell alakulni, egy szakasznak pedig ki kell vágódnia ahhoz, hogy két különálló lánc keletkezzen (amelyeket csak a diszulfidkötések kapcsolnak össze). Az inzulin csak ekkor válik biológiailag aktívvá, azaz a szervezetben működni képes hormonná.

A cukorbetegeknek szánt inzulin előállításához ezeket a műveleteket is el kell végezni a fehérje tisztítása során, hogy az inzulinfehérje elnyerje pontos háromdimenziós alakját.

A DNS-klónozás alkalmazási lehetőségei

A klónozással előállított DNS-molekulákat a molekuláris biológia számos célra alkalmazza. Ezek közül néhány:

Biológiai gyógyászati termékek. Gyógyászati célra DNS-klónozással készíthetők emberi fehérjék, mint a fent említett inzulin. A rekombináns fehérjékre példaként megemlíthető még az emberi növekedési hormon azon betegek számára, akik nem képesek azt előállítani, vagy a szöveti plazminogén aktivátor (tPA), amely az agyi érkatasztrófák kezelésére és a vérrögképződés megakadályozására alkalmas. Az ehhez hasonló rekombináns fehérjéket gyakran termeltetik baktériumokban.
Génterápia. Egyes genetikai rendellenességekben szenvedő betegekben hiányzik valamelyik gén működő formája. A génterápia arra tesz kísérletet, hogy a beteg sejtjeibe bejuttassa a normálisan működő gént. DNS-klónozással állítottak elő például olyan plazmidokat, amelyek a cisztás fibrózisban nem működő gén normális változatát tartalmazzák. Amikor ezeket a plazmidokat cisztás fibrózisban szenvedő betegek tüdejébe juttatták, az lassította a tüdőfunkciók romlását. $^{2}$ ‍
A génműködés kutatása. Az alapkutatásban dolgozó biológusok gyakran alkalmazzák a DNS-klónozást mesterséges rekombináns génváltozatok létrehozására, hogy megértsék a normál gének működését.
Az ecetmuslicák neuronjait vizsgáló kutatók például DNS-klónozással készítenek riporter gént az idegsejtekben működő egyik génből. Ebben a termékben a gén szabályozó régióját (promóterét) egy fluoreszcens fehérjét kódoló gén elé illesztik be. A muslicába bejuttatott „riporter gén” ugyanazokban a neuronokban fejeződik ki, mint maga az eredeti gén, így ezek az idegsejtek UV fényben világítanak (fluoreszkálnak).

Mindez csak néhány példa a DNS-klónozás napjainkban történő biológiai alkalmazására. A DNS klónozása széles körben elterjedt technika, amelyet a molekuláris biológia számos területén használnak.

A Khan Academyn kívüli további információk

Szeretnél többet megtudni a restrikciós enzimekről? Tekintsd meg (angolul) ezt a görgethető interaktív bemutatót és ezt a szimulációt a LabXchange weboldalán!

Szeretnél többet megtudni a DNS-ligáz szerepéről a DNS-klónozásban? Tekintsd meg (angolul) ezt a görgethető interaktív bemutatót és ezt a szimulációt a LabXchange weboldalán!

Szeretnél többet megtudni a baktériumtranszformációról? Nézd meg ezt a szimulációt (angolul) a LabXchange weboldalán!

Szeretnél többet megtudni a transzformált baktériumok szelekciójáról? Nézd meg ezt a szimulációt a LabXchange weboldalán!

A LabXchange ingyenes online természettudományos oktatási platform, amelyet a Harvard’s Faculty of Arts and Sciences hozott létre, és amelynek az Amgen Foundation a támogatója.

Ez a tananyag a CC BY-NC-SA 4.0 licenc által engedélyezett.

Idézett munkák:

Superbest. (2014, June 11). How does heat shock transformation work? In Biology stack exchange. Hozzáférhető itt: http://biology.stackexchange.com/questions/19038/how-does-heat-shock-transformation-work.
Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

További hivatkozások:

Affibody. (n.d.). Insulin capture from human serum. Hozzáférhető itt: http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.

Amgen Biotech Experience. (2015). Student guide. Hozzáférhető itt: https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.

Biotechnology. (2016, March 23). Utolsó hozzáférés: Wikipedia, 2016 március 29.: https://en.wikipedia.org/wiki/Biotechnology.

Gebel, E. (2013). Making insulin: A behind-the-scenes look at producing a lifesaving medication. In Diabetes forecast. Hozzáférhető itt: http://www.diabetesforecast.org/2013/jul/making-insulin.html?referrer=https://www.google.com/.

Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (2015, July 3). In NHS choices. Hozzáférhető itt: http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.

R&D Systems. (2016). Recombinant human growth hormone (GH) protein. In Growth hormone. Hozzáférhető itt: https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-growth-hormone-gh-protein_1067-gh.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. In Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (2016, March 23). Gene cloning - advanced. In CK-12 biology advanced concepts. Hozzáférhető itt: http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

Szeretnél részt venni a beszélgetésben?

Jelentkezz be

Rendezés:

Még nincs hozzászólás.

Tudsz angolul? Kattints ide, ha meg szeretnéd nézni, milyen beszélgetések folynak a Khan Academy angol nyelvű oldalán.

Biológia

Tantárgy/kurzus: Biológia > 9. témakör