Fő tartalom

Restrikciós enzimek és a DNS ligáz

Restrikciós emésztés. Ragadós és tompa végek. Ligálási reakciók

Főbb pontok

A restrikciós enzimek DNS-hasító enzimek. Minden ilyen enzim egy vagy néhány célszekvenciát képes felismerni, és vagy ezeken a helyeken, vagy ezek közelében elvágja a DNS-t.
Sok restrikciós enzim aszimmetrikusan, vagyis lépcsőzetesen vág: az egyik DNS-szál rövidebb lesz, mint a komplementere, azaz az elvágott végeken túlnyúló DNS-szálak keletkeznek. Más enzimek szimmetrikusan vágnak, úgynevezett „tompa végeket” produkálva.
A DNS ligáz egy DNS-t összeillesztő enzim. Ha két DNS-darab végződése esetében fennáll a komplementaritás, a ligáz képes összekapcsolni őket egyetlen DNS-molekulává.
A DNS klónozása során restrikciós enzimeket és DNS ligázt használunk arra, hogy géneket és más DNS-darabokat plazmidokba illesszünk.

Hogyan lehet kivágni és beilleszteni a DNS-t?

A DNS klónozása során a kutatók sok másolatot készítenek egy DNS-darabról, például egy génről. Ez gyakran úgy történik, hogy a kérdéses gént egy kör alakú DNS-be, ún. plazmidba illesztik, amit aztán baktériumsejtekben lehet sokszorosítani.

Hogyan lehetséges két eltérő forrásból származó DNS-t, például egy emberi gént és egy baktérium plazmidját összeilleszteni egyetlen molekulává? Az egyik leggyakoribb módszer erre a restrikciós enzimeken és a DNS ligázon alapul.

A restrikciós enzimek olyan DNS-hasító enzimek, melyek a DNS adott helyeit ismerik fel. Sok restrikciós enzim aszimmetrikusan, vagyis lépcsőzetesen vágja el a DNS-t a felismerés helyénél, vagy annak közelében. Ilyenkor az egyik DNS-szál rövidebb lesz, mint a komplementere, azaz az elvágott végeken túlnyúló DNS-szálak keletkeznek.
Ha két DNS-darab túlnyúló szála illeszkedik egymáshoz, akkor a DNS ligáz enzim össze tudja kapcsolni a két darabot. A túlnyúló végek megfelelő bázisai között hidrogénkötések jönnek létre, majd a ligáz, új foszfodiészter kötések kialakulását katalizálva „befoltozza” a rést a két DNS-darab között, egyetlen molekulát alkotva belőlük.

A restrikciós enzimeket és a DNS ligázt gyakran használjuk arra, hogy géneket és más DNS-darabokat illesszünk plazmidokba, például a DNS klónozása során.

Restrikciós enzimek

A restrikciós enzimek baktériumokban (és más prokariótákban) fordulnak elő. Képesek arra, hogy a DNS egy meghatározott szekvenciáját (a restrikciós helyet) felismerjék, és ahhoz kötődjenek. A restrikciós enzimek specifikusak, ami azt jelenti, hogy csak egy vagy kevés restrikciós helyet ismernek fel. Ha megtalálják a keresett szekvenciát, elvágják a DNS mindkét szálát. Ez a vágás jellemzően a felismerés helyén vagy annak közvetlen közelében történik, és a folyamat mindig pontosan ugyanúgy játszódik le.

Figyeljük meg a laboratóriumokban is gyakran használt EcoRI enzim példáján, hogy a restrikciós enzimek hogyan ismerik fel és hasítják a DNS bizonyos szekvenciáját! (Az „Eco” az Escherichia coli-ra utal, az I római 1-est jelöl.) Az EcoRI az alábbi szakaszt vágja el:

Az EcoRI a megfelelő szekvencia felismerése után mindig egy rá jellemző módon hasít, melynek eredménye két DNS-darab, amelyek „túlnyúló” egyszálú DNS-végekkel rendelkeznek:

Ha egy másik DNS-darab olyan túlnyúló véggel rendelkezik, amely az elsővel komplementer (például mert azt is egy EcoRI enzim vágta el), akkor ezek a túlnyúló végek könnyen összeállhatnak a bázispárosodás elvét követve. Ezért szokás azt mondani, hogy a túlnyúló végeket kialakító enzimek „ragadós végeket” hoznak létre. A ragadós végek nagyon hasznosak a klónozás során, hiszen a bázispárok közti hidrogénhidak segítenek összetartani a két DNS-darabot, amíg a ligáz létre nem hozza az új foszfodiészter kötést a cukor-foszfát gerincben.

Léteznek más típusú enzimek is, amelyek a ragadós végek helyett úgynevezett „tompa végeket” hoznak létre. A célszekvencia közepén teljesen átvágják a DNS-t és így nem keletkeznek túlnyúló szálak. Például az SmaI restrikciós enzim is ilyen tompa végeket vág:

A tompa végű DNS-darabokat a korábbiakhoz hasonlóan egy DNS ligáz enzim kapcsolja össze. Ugyanakkor a tompa végű fragmentek összekapcsolása jóval nehezebb (a ligálás reakciója kevésbé hatékony és nagyobb eséllyel lesz hibás), mert ebben az esetben nincsenek egyszálú túlnyúló végek, amelyek a két DNS-t a megfelelő helyzetben tartanák.

A restrikciós enzimek arról a prokarióta fajról kapják a nevüket, amelyikből először izolálták őket. Például az Escherichia coli nevű baktériumból izolált enzimek neve mindig Eco-val kezdődik (mint az EcoRI esetében is).

Több mint

3000

restrikciós enzimet izoláltak már különféle organizmusokból. Az alábbi táblázat ezek közül mutat be párat:

Név	Forrás	Felismerési szekvencia	A vágás helye
EcoRI	Escherichia coli	$\begin{aligned} 5^{'} - GAATTC - 3^{'} \\ 3^{'} - CTTAAG - 3^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - G ↓ AATTC - 3^{'} \\ 3^{'} - CTTAA ↑ G - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	$\begin{aligned} 5^{'} - GGATCC - 3^{'} \\ 3^{'} - CCTAGG - 3^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - G ↓ GATCC - 3^{'} \\ 3^{'} - CCTAG ↑ G - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
HindIII	Haemophilus influenzae	$\begin{aligned} 5^{'} - AAGCTT - 3 \\ 3^{'} - TTCGAA - 5^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - A ↓ AGCTT - 3 \\ 3^{'} - TTCGA ↑ A - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
SmaI	Serratia marcescens	$\begin{aligned} 5^{'} - CCCGGG - 3 \\ 3^{'} - GGGCCC - 5^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - CCC ↓ GGG - 3 \\ 3^{'} - GGG ↑ CCC - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
SacI	Streptomyces achromogenes	$\begin{aligned} 5^{'} - GAGCTC - 3 \\ 3^{'} - CTCGAG - 5^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - GAGCT ↓ C - 3 \\ 3^{'} - C ↑ TCGAG - 5^{'} \end{aligned}$ ‍

A módosított táblázat forrása: CK-12 Foundation (CC BY-NC-SA 3.0): "Common restriction endonucleases.

DNS ligáz

Ha korábban már tanultál a DNS replikációról, akkor találkozhattál a DNS ligázzal is. A replikáció során a ligáz feladata az, hogy összekapcsolja az újonnan szintetizált DNS-szakaszokat egyetlen összefüggő szállá. A DNS-klónozás során használt ligáz is tulajdonképpen ugyanezt teszi: ha két DNS-darab végződése egymáshoz illő (komplementer), akkor a ligáz képes összekapcsolni őket egyetlen molekulává.

Hogy mit is csinál pontosan a DNS ligáz? ATP felhasználása mellett katalizál egy reakciót, amely során az egyik DNS-szál 5' végén lévő foszfát-csoport összekapcsolódik a másik DNS-szál 3' végén lévő hidroxil-csoporttal. A folyamat végeredményeképpen egy egybefüggő cukor-foszfát lánc jön létre.

Példa: Rekombináns plazmid összeállítása

Nézzük meg, hogy a restrikciós emésztés és a ligálás folyamatát felhasználva hogyan lehet egy gént egy plazmidba illeszteni. Tegyük fel, hogy van egy beillesztendő génünk, a két végén egy-egy EcoRI felismerési szekvenciával, valamint van egy plazmidunk, amely szintén tartalmazza ugyanezt az EcoRI felismerő helyet.

A célunk az, hogy az EcoRI enzim segítségével beillesszük a gént a plazmidba. Ehhez először megemésztetjük (elvágjuk) külön a géndarabot és külön a plazmidot is az EcoRI enzimmel. Ebben a lépésben ragadós végek jönnek létre:

Ezután vesszük a géndarabot és a linearizált (felnyitott) plazmidot, és DNS ligázzal keverjük össze őket. A ragadós végek a komplementer bázispárosodás elve szerint összekapcsolódnak:

A DNS ligáz összeköti a géndarabokat, így a beillesztendő gén és a felnyitott plazmid egyetlen folytonos DNS-molekulává válik. Összefoglalva az eddigieket, a beillesztendő gén beépült a plazmidba, vagyis egy ún. rekombináns plazmid jött létre.

A restrikciós emésztés és ligálás során sokféle DNS keletkezhet

A fenti példa egy EcoRI enzimmel vágott gén és plazmid ligálásának az egyik lehetséges eredményét mutatta be. Ugyanez a folyamat viszont más eredménnyel is járhat. Például a plazmid recirkularizálódhat (visszazáródhat) anélkül, hogy a gén beépülne. A gén akár fordított irányban beépülhet a plazmidba (mivel a két végén lévő EcoRI ragadós végek egyformák).

Az ehhez hasonló restrikciós emésztések és ligálások során a gyakorlatban a plazmid és a gén sok-sok másolatát használjuk. Egyetlen ligálási reakcióhoz akár több milliárd molekulányi DNS-t is felhasználunk! Ezek a molekulák többféle véletlenszerű módon ütköznek egymásal és a DNS ligázzal. Ezért ha többféle termék is keletkezhet, biztosra vehető, hogy mindegyik fog keletkezni valamilyen arányban – köztük olyanok is, amiket nem szeretnénk.

Hogyan kerülhetjük el a „rossz” plazmidok keletkezését? Amikor baktériumokat transzformálunk egy ligálásból származó DNS-sel, mindegyik baktérium másféle DNS-darabot vesz fel. A transzformálás után ellenőrizhetjük a baktériumokat, hogy csak azokat használjuk tovább, amelyekben a megfelelő plazmid van. Sokszor a transzformált baktériumból kinyert plazmidon egy újabb restrikciós emésztést végeznek, hogy ellenőrizzék, a helyes gén épült-e be a helyes irányban.

A Khan Academyn kívüli további információk

Szeretnél többet megtudni a restrikciós enzimekről? Tekintsd meg (angolul) ezt a görgethető interaktív bemutatót és ezt a szimulációt a LabXchange weboldalán!

Szeretnél többet megtudni a DNS ligázról? Tekintsd meg (angolul) ezt a görgethető interaktív bemutatót és ezt a szimulációt a LabXchange weboldalán.

A LabXchange ingyenes online természettudományos oktatási platform, amelyet a Harvard’s Faculty of Arts and Sciences hozott létre, és amelynek az Amgen Foundation a támogatója.

Források:

Ez a cikk a CK-12 Foundation (CC BY-NC 3.0) által közölt "DNA cloning - Advanced" című cikk módosított változata.

A módosított cikket a CC BY-NC-SA 4.0 licenc által engedélyezték.

Hivatkozások:

Bergmann, D. (2011). Biotechnology. [Course handout] In BIO41: 2011 Molecular Biology lectures on DNA, RNA, and biotechnology.

Metzenberg, S. (2002). Lecture 5: Restriction endonucleases. In Recombinant DNA techniques. Hozzáférhető itt: http://escience.ws/b572/L5/L5.htm.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. In Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Restriction site. (2015, December 7). Utolsó hozzáférés: 2016 március 31. Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_site.

Restriction endonucleases. (2016). In New England biolabs. Hozzáférhető itt: https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases.

Szeretnél részt venni a beszélgetésben?

Jelentkezz be

Rendezés:

Még nincs hozzászólás.

Tudsz angolul? Kattints ide, ha meg szeretnéd nézni, milyen beszélgetések folynak a Khan Academy angol nyelvű oldalán.

Biológia

Tantárgy/kurzus: Biológia > 9. témakör