A DNS bázissorrendjének meghatározása (DNS-szekvenálás)

Gondolkodtál-e már azon, hogyan szekvenálják a DNS-t? Tekintsük át röviden, hogy mi is az a DNS-szekvenálás. A folyamat három lépésre bontható. Az első lépésben a szekvenálni kívánt DNS mintát PCR módszerrel felsokszorozzuk. A PCR-rel végzett felsokszorozás nyomán rengeteg másolat keletkezik a DNS fragmentumokról. Ezután valami szokatlan következik. A PCR során rendszerint nukleotidokat adunk a reakcióhoz, és az új szál ezekből épül fel. Az új szálba tehát közönséges dezoxinukleotidok épülnek be. Ezek nagyjából így néznek ki. Itt van egy hidroxilcsoport, itt van egy hidrogénatom, itt van egy bázis, itt egy metiléncsoport, egy oxigén és egy hidrogén. Így néz ki egy közönséges nukleotidrészlet (a foszfátcsoport nélkül). Most azonban a PCR reakcióelegyhez úgynevezett dideoxinukleotidokat is keverünk. Így néz ki egy dideoxinukleotid (foszfátcsoport nélkül). Lényegében hasonlít az előbbihez, de itt csak egy hidrogénatomja van. Innen tehát hiányzik egy oxigén. Ha ez a dideoxinukleotid (rövidítve ddNTP) beépül a készülő új DNS-szálba, akkor a hiányzó oxigénatom miatt a lánchosszabbítás nem halad tovább. Ezzel tehát leállítjuk a lánchosszabbítást, amint ez a ddNTP beépül. Jelöljük meg fluoreszcens festékkel a különböző dideoxinukleotidokat! Négyféle lehetőségünk van: a guaninokat (G) jelöljük kékkel, az adenineket (A) pirossal, a timineket (T) zölddel, a citozinokat (C) pedig narancssárgával. Így tehát a különböző dideoxinukleotidok, amelyeket különböző fluoreszcens festék jelöl, beépülnek a készülő új szálba. Minthogy a PCR során milliószámra képződnek a DNS fragmentek, különböző hosszúságú szálak sokasága keletkezik. Lássuk, mi történik. Tegyük fel, hogy ide beépül egy közönséges nukleotid. azután egy második, azután még egy, majd egyszerre csak véletlenszerúen beépül egy dideoxinukleotid, ami leállítja a lánchosszabbítást. Itt van tehát egy DNS-szál, amely mindössze négy nukleotidból áll. A következő PCR ciklusban újabb szál kezd épülni. 1, 2, 3, 4, 5, 6... egyre hosszabb lesz, egyszerre csak mi történik? Ide is beépült egy dideoxinukleotid. Lényegében ez ismétlődik tovább. A keletkező milliónyi másolat ehhez hasonló szálakat eredményez. Lesznek olyan szálak, amikben az első normál nukleotid után máris beépült egy dideoxinukleotid. Lesznek olyanok is, amelyekbe két normál nukleotid épült be, és a harmadik helyre épül be egy dideoxinukleotid (más színnel jelölve). Tehát a lánchosszabbítás közben az egyes szálak növekedése különböző pontokon szakad félbe, a dideoxinukleotidok beépülése miatt. Ezután gélelektroforézist végzünk, hogy méret szerint szétválogassuk a szálakat. A különböző fragmenteket megfuttatjuk a gélben, ami méret szerint elkülöníti őket. Ezután számítógép segítségével elemezzük a fluoreszcens jelöléseket. Ha itt érzékeli a kék fluoreszcens festéket, az azt jelenti, hogy a sorrendben a második nukleotid egy G. Azután ezt olvassa le, és megállapítja, hogy itt egy C van. Itt van egy újabb G, és így tovább. A számítógép tehát, leolvasva a fluoreszcens jelöléseket, képes megállapítani a DNS bázissorendjét. Röviden összefoglalva, így működik a DNS-szekvenálás.