A polimeráz láncreakció (PCR)

Vendégem Emily, a biológiai tartalmakért felelős munkatársunk, aki a PCR-ról (polimeráz láncreakció) fog beszélni, amelyben ő eléggé járatos. Miért dolgoztál PCR-ral? – A PCR a diplomamunkám alappillére volt. Sokféle rekombináns DNS-t készítettem növénytani vizsgálatokhoz. – Pontosan mire való a PCR? – A PCR lényegében rengeteg másolatot készít egy adott DNS-szakaszról, amelyet tanulmányozni szeretnénk. – És mihez kell ennyi másolat egy adott DNS-szakaszról? – Például ahhoz, hogy a másolatokat egy plazmidba klónozhassuk, különféle kísérletekhez. Ehhez nagyon hasznos. – Amikor tehát klónozásról beszélünk, DNS-szakaszok beépítéséről egy plazmidba, nem egyetlen szakaszról van szó, hanem egyszerre sokról. Ehhez sok DNS-fragmentum szükséges. – Pontosan így van. – És ehhez néha igen kevés DNS-mintából kell kiindulni. Milyen más célra használható a PCR? – A PCR-t gyakran használják a kriminalisztikában, akárcsak az orvosi diagnosztikában. Akár a te DNS-edet is megvizsgálhatnák, hogy van-e olyan géned, amely valamilyen betegségre hajlamosít. A PCR sokféle gyakorlati célra használható. – Mivel egyetlen példányban nehéz volna azonosítani egy gént, másolatokat kell róla készíteni, szaknyelven amplifikálni kell ahhoz, hogy például futtassuk egy gélben, és megállapítsuk e molekulák méretét és egyebeket. – Pontosan. Ha csak annyi DNS-sel dolgoznánk, mint amennyi egy sejtben van, az olyan volna, mint a tű a szénakazalban. Így alaposabban meg tudjuk őket vizsgálni. – Rendben. Rajzoltál ide néhány ábrát. Én ugyan sohasem végeztem PCR-t, de te igen, ezért elmondom, hogy mit értek mindebből, és te megmondod, hogy van-e ennek értelme. Amit ide rajzoltál, az egy kettős szálú DNS. Ez akár valakinek a hajszálából is származhat. Tehát ezt szeretnénk másolni, sok-sok másolatot készíteni erről a szakaszról. Tegyük fel, hogy a kérdéses szakasz innentől idáig tart. Ez az a szakasz, amelyet sokszorosítani szeretnénk. Az első lépés a denaturáció (alig tudom kimondani). – Elég furcsa szó. – Elég furcsa. A hőmérséklet 96 Celsius fok, ez majdnem a víz forráspontja, tehát nagyon forró. Ez választja szét a két szálat. – Pontosan. – Miután szétváltak, lehűtjük a közeget, bár ez sem annyira hideg. Számunkra az 55 fok nagyon kellemetlen lenne. Ilyen hőmérsékletre hűtjük, és ekkor megjelennek ezek a primerek. Ne feledjük, hogy ez az egész folyamat kémcsőben, egy oldatban zajlik le. Tehát felmelegítettük a DNS-t, a két szál szétválik. Ezek a primerek csak úgy ott hevernek a laborban? – A primereket cégektől rendeljük, elég nagy mennyiségben. Bőven adunk primert a reakcióhoz, ezzel lesz jó esélyünk arra, hogy az úgynevezett megkötődési szakaszban minél több DNS-darabhoz kötődjön hozzá egy-egy primer. – Ide rajzoltam az oldatot. Mindez vízben történik? – Vizes oldatban, amely sókat és egyéb anyagokat tartalmaz. – Rendben. Szóval itt az oldat. Beletesszük a kiindulási DNS-mintát. Ismétlem, ez nagyon kis mennyiség. Jó sok primert adunk hozzá, hogy feleslegben legyenek (ezt vörössel rajzolom). Ez szabad szemmel nem látszik, hisz oldatban vannak. – Csak egy folyadékcseppnek látszik. – A láthatóság kedvéért jó sok primert rajzolok. Tehát ezt felmelegítjük, a DNS-szálak szétválnak, és mikor visszahűtjük, a primer specifikusan illeszkedni fog a másolni kívánt régió végeihez. – Így van. – Ha online vagy bárhonnan rendelünk egy bizonyos primert, akkor úgy adjuk meg a primer szekvenciáját, hogy illeszkedjen a másolandó szakaszhoz. – Pontosan. Ez nagyon fontos. – Rendben. Amikor visszahűtjük, a primerek megkötődnek. Ezután újra felmelegítjük, de nem egészen 96 Celsius fokra, hanem csak 72 fokra, hogy elkezdjük a lánchosszabítást. Feltételezem, hogy mivel polimeráz láncreakciónak hívják, ekkor jut majd szerephez a polimeráz. – Pontosan most következik a polimeráz. – Tehát a polimeráz az, ami a láncot hosszabbítja. Iderajzolok egy polimeráz enzimet, ahogy épp hosszabítja a láncot. Lehetne ez bármilyen típusú polimeráz enzim? Kivonhatnék-e a sejtjeimből némi polimerázt, hogy a kémcsőbe dobjam? – Ehhez különleges polimeráz kell, olyanra, amely elég hőálló. Ahogy mondtad, még a hűtési szakasz hőmérséklete is túl magas lenne az emberi szervezetnek. Ez a polimeráz tehát egy hőtűrő mikroorganizmusból származik. – És mi a neve? Nem ez a Taq-polimeráz? – Thermophilus aquaticus, azt hiszem. Szép hosszú név. – Hőforrásokban találták ezt az előlényt, amely elviseli ezt a magas hőmérsékletet. Ez viszont egy másik kérdéshez vezet: miért kell már az elején melegítéssel kezdeni? Azért, hogy a két szál szétváljon? – Valóban ez a fő ok. Szét kell őket választani. Itt ehhez nincs enzim, mint a sejtekben, így hővel dolgozunk. – Rendben, eddig értem. Most már sejtem, hogy mit jelent a „polimeráz” szó a PCR nevében. Tehát melegítés hatására a szálak szétválnak, aztán itt ez a sok-sok primer... Mivel rengeteg a primer, sokkal nagyobb az esély a megkötődésükre a DNS-nek ezen a szakaszán, mint arra, hogy ez a két szál újra összekapcsolódjon. Most jön a polimeráz, pontosabban a Taq-polimeráz, amit még a reakció legelején hozzáadtak. A Taq-polimerázt sárgával jelölöm. Tehát hozzáadtuk a Taq-polimerázt is. Ismétlem, ezek nem robotok, nem tudják, mi a feladatuk, csak megfelelő módon ütköznek és reagálnak. És persze nukleotidokat is kell hozzájuk adni. – Igen, így igaz. A reakció nem működik, ha kifelejtjük a nukleotidokat. – A Taq-polimeráz az újabb felmelegítés közben, a primerek megkötődése után elkezdi beépíteni a nukleotidokat. Meddig tart ez? Talán a végtelenségig? – Egy ideig folytatódik. Általában úgy állítjuk be a lépés hosszát, hogy legyen elég ideje a polimeráznak ahhoz, hogy elkészüljön a kívánt szakasszal. De egy idő után leáll. Vagy leesik a szálról, vagy leáll, amikor áttérünk a következő lépésre. – Rendben, eddig értem. Tehát egy ciklus után, ahogy ide írtad, egy ciklus után megdupláztuk a láncot, legalábbis a kívánt szakaszát. Bár a másolás ezen a szakaszon túl is folytatódhat. De hogy lesz ebből a láncreakció? – A láncreakció kétféleképpen is értelmezhető. Az egyik a polimeráz működése, amikor lánccá fűzi a hozzávalókat, de valójában ennél többről van szó. Arról, hogy a folyamat exponenciális léptékben zajlik. – Tehát egy ciklus után idáig jutunk. Felmelegítjük, a szálak szétválnak, lehűtjük, a primerek megkötődnek, újra felmelegítjük, a Taq-polimeráz elvégzi dolgát. Mint minden polimeráz, ez is 5' → 3' irányban működik, erről korábban beszéltünk. – Így van. – Már két szálunk van. Most, hogy már minden benne van az oldatban, újra felmelegíthetjük, és ez a két szál... vagyis ez a két kettős szál szétválik négy darab egyes szállá, ezután újra lehűtjük, ekkor hozzájuk kapcsolódnak a primerek. Ugyanolyanok, mint előbb, hisz még mindig ugyanazt a szekvenciát másoljuk. Így lesz egyből kettő, majd négy, és ezt ismételjük újra és újra. Tipikus esetben hányszor ismételjük ezt a ciklust? – Általában 35 körüli ciklust végzünk. Attól is függ, mivel dolgozunk, de jó sokszor meg szoktuk ismételni. – Ha ezt 35-ször hajtjuk végre, akkor a számot minden alkalommal megduplázva az eredmény 2 a 35-ötdik hatványon, ami jóval több, mint egymilliárd, Mennyi időbe telik mindez? Te már csináltál ilyet. – Ez a DNS-szakasz hosszától függ, de általában 2-3 óra. – Tehát 2-3 óra alatt egy DNS-szakaszból egymilliárd lesz. – Igen, ha teljesen hatékony, ami többnyire csak vágyálom, de azért általában elég sok másolat készül. – Egyvalamire mindig is kíváncsi voltam, amikor először tanultam erről, és szeretném ezt a laborotokban is kipróbálni. Odáig már értem, hogy ha megvan a primer, akkor a polimeráz tovább hosszabbítja a láncot, de honnan tudja, hogy hol kell megállni? Elmondtad, hogy amikor először megy végig a láncon, lehet, hogy nem tudja, hol álljon meg, de amikor elindul a másik irányba, itt, ezen a szakaszon, amikor a másik irányba halad, beleütközik a... Nem talál semmit, amit lemásoljon. – Pontosan. – Tehát az előállított milliárdnyi molekula többségének mindkét végén szép tiszta vágás lesz. – A túlnyomó többségüknek igen. – Ez lenyűgöző.