A DNS klónozása és a rekombináns DNS

Beszéljünk egy kicsit a DNS klónozásáról, ami abból áll, hogy másolatokat készítünk egy adott DNS-szakaszról. Általában olyan DNS-szakaszról, amely valami fontos dolgot kódol. Például egy gént, amelyről olyan fehérje fejeződik ki, amely valamiért hasznos a számunkra. A klónozásról talán abban az értelemben is hallottál már, ami például a Csillagok háborújában a klónháború vagy a Dolly nevű bárány. A lényeg itt is ugyanaz. Egy állat, például egy bárány klónozásával olyan állatot hozunk létre, amely genetikailag megegyezik az eredeti állattal. A DNS-klónozás során azonban ennél egyszerűbb dolgoról van szó. Bár, mint látni fogjuk, ez is lenyűgöző. Egy DNS-szakaszról készítünk pontos másolatokat. Hogyan kell ezt csinálni? Mondjuk, ez itt egy DNS-szál, Csak egyetlen vonallal jelölöm, de valójában két szálból áll. Ide is írom, hogy kettős szálú. Nem akarok azzal vesződni, hogy mindkét szálat megrajzoljam. Habár inkább mégiscsak megrajzolom mindkét szálat, a pontosság kedvéért. Kész is van. Ez itt a kettős szálú DNS. Tegyük fel, hogy ezen a szakaszon van egy gén, amit klónozni szeretnénk. Erről szeretnénk másolatokat készíteni. Ez tehát a klónozandó gén. Az első lépésben valahogy ki kell vágni ezt a gént. Ehhez restrikciós (hasító) enzimeket használunk. Sokféle restrikciós enzim létezik. Szerintem az is egy csoda, hogy a civilizációnk eljutott arra a fejlettségi szintre, hogy felfedeztük ezeket az enzimeket, és tudjuk, hogy mely pontokon tudják hasítani a DNS-t, felismerve a jellemző hasítási helyeiket, így eldönthetjük, hogy melyik restrikciós enzimet használjuk egy bizonyos DNS-darab kivágására. Hát ilyen szintre jutott a civilizációnk. Tehát restrikciós enzimeket használunk. Az egyik hasító enzim (ezt más színnel jelölöm) ide kapcsolódik, itt ismeri fel a bázissorrendet, és épp a kívánt helyen vágja el a DNS-t. Tehát ez az egyik restrikciós enzim. Egy másik hasító enzim pedig a túlsó végen ismeri fel a vágási helyét jelző bázissorrendet. Ezt meg is jelölöm. Ezek a restrikciós enzimek. Miután a hasító enzimek elvégezték a feladatukat, csak a kívánt gén marad. Lehet, hogy marad egy kis „fölösleg” a végein, de lényegében kivágtuk a gént. Restrikciós enzimeket alkalmazva kivágtuk a gént. Most ezt a gént be kellene illeszteni egy úgynevezett plazmidba. A plazmid egy darabka örökítőanyag, amely a kromoszómákon kívül helyezkedik el, de együtt másolódik, azaz replikálódik a fő örökítőanyaggal. Géneket is kifejezhet, akárcsak a kromoszómákban lévő gének. Tehát itt vágjuk ki (ideírom), itt vágjuk ki a gént, majd beillesztjük egy plazmidba. A plazmidok többnyire kör alakú DNS-ek. Tehát beillesztjük egy plazmidba. A beillesztést gyakran megkönnyítik ezek a túlnyúló végek. Rajzolok egyet ide is is, meg oda is. A beillesztésre használt plazmidban lehetnek a túlnyúló végekhez illeszkedő kiegészítő bázispárok, ami megkönnyíti az összekapcsolódást, ha vannak ilyen túlnyúló végeik. Be is illesztem a gént a plazmidba. Ez is fantaszikus, hiszen a DNS-t nem lehet csak úgy kézzel megfogni, mint ahogy beragasztunk valamit valahová. Mindez oldatokban zajlik, amikbe beletesszük a hasítóenzimeket, amik egy rakás különféle molekula között végzik a hasítást, amikor éppen jó helyre kerülnek, hogy elősegítsék ezt a reakciót. Aztán fogjuk ezeket a géneket, hozzáadjuk a plazmidokat, amelyek végein épp megfelelő a bázissorrend, hogy össze tudjanak kapcsolódni. Az oldatba DNS-ligázt is teszünk, ami összekapcsolja a DNS gerincét. A DNS-ligázzal már találkoztunk a replikáció során. Ez tehát a DNS-ligáz, amely szintén kell a beillesztéshez. Most tehát itt ez a plazmid, és be kellene juttatni egy élőlénybe, amely majd másolatokat készít róla. A legtöbbször használt ilyen élőlény, illetve ilyen típusú élőlény egy baktérium, közelebbről az E. coli. Fogunk tehát egy ampullát, benne olyan oldattal, amelyben E. coli baktériumok vannak. Ezek persze nem láthatók szabad szemmel, de az oldatban ott vannak az E. coli baktériumok. Ezután hozzáadjuk a plazmidokat (amik még ennyire sem láthatók) ehhez az oldathoz, hogy az E. coli baktériumok felvegyék ezeket. Ehhez többnyire valamilyen sokkhatást alkalmaznak, amitől a baktérium felveszi a plazmidot. Ez leggyakrabban hősokk. Nem teljesen világos, hogy a hősokk hogyan működik, de működik, ezért hát használják. Ez itt tehát egy baktérium, aminek megvan a saját DNS-e, ide rajzolom a már meglévő genetikai anyagát. Ide is írom, mi ez. Ez a baktérium. Hozzáadjuk a plazmidot, és hősokkot alkalmazunk. A baktériumok egy része felveszi a plazmidot, így ni. Ezután az oldatot és a benne lévő baktériumokat – amelyek közül egyesek felvették a plazmidot – szétszélesztjük egy lemezen, hogy ott szaporodjanak. Ezt is iderajzolom. Ezen a lemezen tenyésztjük a baktériumokat. Tápanyagok vannak benne, amin a baktériumok növekedhetnek. Szóval itt szaporítjuk a baktériumokat. Ezt fogjuk látni, sok-sok baktériumot, amelyek telepeket alkotva szaporodnak. Van azonban egy probléma. Mint említettem, vannak olyan baktériumok, amik fölveszik a plazmidot, mások viszont nem. Hogy különböztessük meg ezeket? A baktériumok a szaporodás során telepeket alkotnak, akárcsak ezen rajzon. Ez a telep olyan, mint amilyet akartunk, meg is jelölöm. Ezt a másik telepet viszont olyan baktérium hozta létre, amelyikbe nem került bele a plazmid, ezért nem tartalmazza a kérdéses gént sem. Erre nincs szükségünk. Hogyan válasszuk ki tehát azokat a baktériumokat, amelyek valóban felvették a plazmidot? Ehhez az kell, hogy a kérdéses gén mellett, amiről másolatokat szeretnénk, egy másik gént is beillesztünk a plazmidba, ami antibiotikum-rezisztenciát okoz. Ide tehát bekerül egy antibiotikum-rezisztencia gén is. Így tehát csak azok a baktériumok... (megint csak ámulok, hogy mi emberek, ilyenekre vagyunk képesek), tehát csak azok a baktériumok, akik felvették a plazmidot, csak azok válnak antibiotikum-rezisztenssé. Ezért a táptalajba antibiotikumot is keverünk. Így ez a baktérium életben marad, mivel rezisztens, benne van a gén, ami megvédi az antibiotikumtól. Ezek viszont nem maradnak életben. Nem fognak szaporodni, mivel a táptalajban antibiotikum van. Ez nagyon menő dolog. Kezdtük a kérdéses génnel. Kivágtuk és beillesztettük egy plazmidba, (ezt megjelölöm) beillesztettük egy plazmidba, ami egy olyan gént is tartalmazott, ami antibiotikum-rezisztenssé tette azokat a baktériumokat, amelyek felvették a plazmidot. A plazmidokat összekevertük a baktériumokkal, és valamilyen sokkhatással, például hősokkal elérjük, hogy a baktérium közül valamennyi fölvegye a plazmidot. A baktérium szaporodni kezd, és szaporodása közben másolja a plazmidokat is. És mivel benne van az antibiotikum-rezisztenica génje, növekszik az antibiotikumot tartalmazó táptalajon, míg más baktériumok, amelyek nem vették fel a plazmidot, nem szaporodnak. Ezután vesszük ezt a telepet, és áttesszük egy másik tápoldatba, vagy itt tenyésztjük tovább, és rengeteg másolatot kapunk a génről, amit bejuttattunk a baktériumba. A következő kérdés az (erősen leegyszerűsítve a dolgot), hogy most, hogy lett egy rakás baktériumunk, és egy csomó másolatunk a génről, mire használható mindez? Nos, maguk a baktériumok... Mondjuk, ez a gén olyasvalamit kódol, amit termelni szeretnénk. Mondjuk, inzulint a cukorbetegeknek. Ehhez a baktériumok életfolyamatait használjuk fel. A szaporodási működésüket használtuk fel a genetikai információ másolására, de a felépítő anyagcseréjük is felhasználható. Ennek során fejeződik ki a saját DNS-ük, de a plazmidban lévő génjeik is. Ez áll az antibiotikum-rezisztencia hátterében is. He pedig itt van az inzulin génje, akkor a baktérium inzulint fog gyártani, amit felhasználhatunk. Nem részletezem, hogyan nyerhető ki az inzulin, és mire használható, de mondanom sem kell, milyen nagy dolog, hogy idáig eljutottunk.