Gélelektroforézis

Tegyük fel, hogy van itt pár ampulla, és a bennük lévő oldatban DNS fragmentumok (töredékek) vannak. Szeretnénk ezt-azt megtudni, a DNS fragmentumokról az első ampullában. Milyen hosszúak ezek a töredékek? Hány bázispárnyi a méretük? Mondhatnád, hogy szedjük ki, és mérjük le őket. Csakhogy ezek hihetetlenül aprók, és rettentő nehéz velük bánni. Még egy viszonylag nagy DNS-fragmentum is – legyen szó mondjuk, 5000 bázispárról – még ez is csak nagyjából 1-2 mikrométer hosszú lenne, ha teljesen kinyújtanánk. Arról nem is szólva, hogy az átmérője milyen kicsi, ha még a hossza is csak 1-2 mikrométer, ami egészen picinyke, a milliméter 1-2 ezredrésze. Ez nemigen segít abban, hogy megpróbáljunk kézzel, vagy más durva eszközzel hozzányúlni. Mit tegyünk hát? És itt a többi ampulla is. Hogyan derítsük ki, hogy mekkora DNS-szálak vannak ezekben? Az erre alkalmas technika a gélelektroforézis. Vizsgálhatunk vele DNS- vagy RNS-szálakat, vagy fehérjéket is, bármelyiket e makromolekulák közül, aminek tudni szeretnénk a hosszát. Ide is írom: gélelektroforézis. Az eljárás neve azért gélelektroforézis, mert egy darab gélben zajlik, és elektromos töltésen alapul, a „forézis” szó pedig arra utal, hogy a DNS-töredékeket vándorlásra kényszerítjük a gélen át, elektromos töltést alkalmazva. A „forézis” szó tehát a vándorlásra utal, a DNS molekulák mozgására. Hogyan kell ezt csinálni? Íme, a berendezés. Ez itt a gél, ami pufferoldatba merül. A gél legtöbbször egy agaróz gél, amely moszatokból kinyert poliszacharid. Szó szerint gél, azaz zselészerű anyag. A következőt fogjuk tenni: mintákat veszünk, egy kevés mintát ebből az ampullából, és áthelyezzük ebbe a zsebbe. A zsebek kis bemélyedések a gélben. Ebből is veszünk egy kis mintát, amit a másik zsebbe teszünk. Aztán pedig ebből veszünk mintát, amit a harmadik zsebbe teszünk. Mindez ebben a pufferoldatban történik, ebben a folyadékban, amit itt látsz. A puffer lényegében egy sóoldat, amely a pH állandóságát biztosítja, hogy ne változzon meg túlságosan, amikor feszültséget kapcsolunk a berendezésre. Ha a pH nagyon megváltozik lúgos vagy savas irányban, az hatással lehet a DNS-re, vagy a DNS töltésére. Ezután pedig feszültséget kapcsolunk a berendezésre. A zsebek felőli oldalra, ahová a DNS-t helyezzük, a negatív elektródát helyezzük. Ez itt a negatív elektróda. A másik végére kerül a pozitív elektróda. Azt használjuk ki, hogy a szokásos pH-viszonyok közt a DNS negatív töltésű, akárcsak a most alkalmazott pH-értéken. Ha visszanézzük a korábbi videókat, ott is láthatjuk a negatív töltéseket a DNS cukor-foszfát gerincén. Mi lesz most? Mi történik, ha ráadjuk a feszültséget, és az egyik oldal negatívvá válik, a másik pedig pozitívvá? Nos, ekkor a DNS vándorolni kezd. Gondoljuk át, hogy mi várható. Vajon a rövidebb töredékek jutnak távolabbra, vagy a hosszabbak? Felelhetnéd azt, hogy a hosszabb darabokon több a negatív töltés, ezért ezek talán messzebbre jutnak. Ám azt se feledd, hogy ezek nagyobb tömeget is cipelnek. A töltés és a tömeg aránya tehát azonos, függetlenül a hosszúságtól. Így az dönti el, hogy mi meddig jut, azaz milyen messzire vándorol adott idő alatt, hogy milyen kicsi a mérete. Emlékezz rá, ez itt egy agaróz gél. Egyelőre nem tudjuk pontosan, hogy a DNS és más makromolekulák hogyan is vándorolnak a gélben, de úgy tekinthetjük, hogy ez a poliszacharid olyan, mint egy háló vagy szita, és a kisebb részecskék könnyebben átjutnak a résein, mint a nagyok. Kis idő múltán a DNS-minta egy része, mondjuk, ez a része idáig jut el. Egy része pedig (csak én színezem ki, valójában nem színesek) csak idáig jut el, kisebb távolságra. Mondjuk, ez a DNS nem vándorol. Egy részük, mondjuk, idáig jut, egy másik pedig idáig. Ha vársz egy kicsit, és újra megnézed, láthatod, hogy a sávok vándorolnak. Minél tovább vársz, annál messzebre jutnak. Ha túl sokat vársz, akkor mind átjutnak a gél másik végére. A látott kép arra utal, hogy ebben a sávban valószínűleg kisebb DNS molekulák vannak. Ezek bizonyára rövidebbek. Ezek kicsit hosszabbak, ezek még hosszabbak, és ebben a csoportban vannak a leghosszabbak. Ez egy keverék volt, amiben voltak nagyon hosszú és kevésbé hosszú szálak is. Tegyük fel, hogy volt még egy pár egészen rövid lánc is, abban a csoportban, amit narancssárgával rajzolok. Így tehát kiderült a láncok egymáshoz viszonyított hossza, de hogy lehetne ténylegesen megmérni őket? Nos, erre valók a standard oldatok, amiket DNS létráknak nevezünk. Szerezzünk be egy ilyen DNS létrát. Ezt rózsaszínnel rajzolom. Ez egyébként tényleg megvehető, akár online is. Mondjuk, hogy a standard oldat így válik szét az összetevőire. Ide kerül az egyik sáv, ide a másik, ide pedig a harmadik. A termék címkéje alapján tudhatjuk (ez a vásárolt terméktől függ), hogy ebben a sávban van az összes olyan DNS, amelyiknek a mérete, mondjuk, 5000 bázispár. Ebben a sávban vannak, mondjuk, a 1500 bázispár méretűek. Ebben pedig az 500 bázispár méretűek. A DNS létra sávjaihoz viszonyítva tehát megállapítható a DNS-ek mérete. Tehát ebben a kék sávban a DNS-ek mérete kicsivel hosszabb, mint 500 bázispár, de rövidebb, mint 1500 bázispár. Ebben a zöld sávban a méret kicsivel hosszabb, mint 1500 bázispár. Nem jutott olyan messzire, mint az 1500-as méretet jelző sáv. Így tehát pontosabb becslést tehetünk. A létra kiválasztása a várható méretek alapján történik, vagy aszerint, hogy mit keresünk. A következő fontos kérdés az, hogy az a DNS-sáv, amely idáig eljutott, egyetlenegy DNS-szálat jelent? A méretek ismeretében nyilvánvalóan nem. Ez itt sok-sok DNS molekula. Nincsenek ennyire kinyújtva. Ne feledd, hogy még az 5000 bázispárnyi lánc is csak 1-2 mikrométer hosszúságú, ha teljesen kinyújtjuk. Tehát nem is látszana. Ez csak a milliméter ezredrésze. Nem is látszana. Ez tehát sok-sok DNS molekula, amik mind eddig jutottak. Nem is kell ilyen kicsinek lenni, ahhoz, hogy vándorolni tudjanak a poliszacharid gélben. Utoljára az vetődhet fel, hogy miképpen válik láthatóvá mindez? Mitől látható a DNS, ha ennyire icike-picike molekula? A válasz az, hogy valamilyen jelzőanyagot kapcsolunk a DNS-hez, hogy látható legyen. Valamilyen festéket, vagy valamilyen fluoreszcens anyagot. Az egyik gyakran használt anyag az etídium-bromid. Az etídium-bromidot beékelődő festéknek nevezik. Ez a molekula itt látható, ez itt a DNS két szála, itt láthatók a bázispárok közötti kötések, és ide illeszkedik az etídium-bromid. Azért nevezzük beékelődő festéknek, mert éppen befér a létra fokai közé, és ilyenkor a DNS belsejében megbújva UV-fény hatására fluoreszkál. Ha tehát etídium-bromiddal kezeljük az összes DNS-mintát, szétválás után a sávok UV-fényben fluoreszkálnak, így láthatóvá válik a mintázat. Ha kíváncsi vagy, hogy milyen a valóságban, nézd meg ezen a képen. Ez itt az egyik zseb (egy kicsit kiemelem, hogy jobban látsszon). Szóval ez itt a zseb, amelyikbe a DNS létrát tettük. Oldalt látható a méretbeosztás. Mondjuk, ezek itt az 5000 bázispár méretű darabok, ezek az 1500-asok, ezek pedig az 500-asok. Ez, mondjuk, egy olyan oldat, amiben egy másik DNS-minta van. Látható, hogy nem jutott olyan messzire, mint az 500-as, tehát ezek a darabok valószínűleg kicsit hosszabbak, mint 500 bázispár, de biztosan sokkal rövidebbek, mint 1500 bázispár. Mint mondtam, nem csak egyféle fragmentünk lehet. Lehetne itt egy másik csoport is, amely pont 1500 bázispár méretű. Láthattál ilyet olyan helyeken, ahol genetikai vizsgálatokat elemeznek. Ilyenkor gyakran láthatod azt, hogy emberek gélelektroforézissel készült gélképeket nézegetnek. Most már tudod, mit is jelent mindez. Ez nem egyetlen DNS-szál, hanem egy rakás DNS molekula, amelyet festékkel jelöltek meg, például etídium-bromiddal. Ez egy rakás molekula, amik a töltésüknél fogva vándoroltak a negatív pólustól a pozitív pólus felé. A kisebb molekulák, mint ezek itt, messzebbre jutnak, mivel könnyebben haladnak előre az agaróz gél térhálós szerkezetében.